首頁 奧林巴斯熒光顯微鏡 熒光顯微鏡 熒光附件  案例應用

Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是帶負電荷且親水的熒光染料系列，該系列染料囊括范圍較廣，且經常用于熒光顯微鏡技術之中。這些染料的名稱是由其發明者Richard Paul Haugland 以他兒子 Alex Haugland 的名字命名的。該產品標識是 Molecular Probes（美國生命科學技術公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收購）的商標。此外，這些產品標識中也涵蓋了相應的激光激發波長。例如，應用范圍很廣且大激發波長為 493 nm的Alexa Fluor®488，可由標準的488 nm激光激發。Alexa Fluor®488的大發射波長為 519 nm，正是因為具備上述特性，使得 Alexa Fluor®488與 FITC 的屬性相似。盡管 Alexa Fluor®488是一種熒光素衍生物，但與 FITC 相反，它擁有更佳的穩定性和熒光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor® 染料（比如，Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）都是不同基礎熒光物質的磺化形式，例如，熒光素、香豆素、青色素或羅丹明，它們的摩爾質量在410 至 1400 g/mol 范圍之內。

圖 2：小鼠轉基因胚胎、肢間體節，E10.5 小鼠轉基因胚胎的 5 個肢間體節：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫組化染色；用 Desmin-Cy3 對胚胎肌肉纖維進行染色，用 Hoechst Size 自上而下揭示細胞核：3.5 mm (a)，800 µm (b)。圖片來源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。

 

圖 3：小鼠成纖維細胞，綠色：F-Actin，FITC；紅色：Tubulin，Cy5；藍色：細胞核，DAPI。圖片來源：德國·海德爾堡·馬克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士

 

DNA 染色

在熒光顯微鏡技術中，不只研究蛋白結構，核酸同樣具有重要的研究意義。有時候，必須通過檢測細胞核來確定細胞的精確位置及其數量。常用的一種DNA 染色劑當屬 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可與DNA 雙螺旋的 A-T 富集區域相結合。如果 DAPI 附著到 DNA 上，其熒光強度將比游離狀態要高。該染色劑受大波長為358 nm的紫外光激發，其發射光譜非常寬，在461 nm 處達到峰值。此外，還可對弱熒光進行 RNA 結合檢測。在這種情況下，發射波長將轉移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠穿透整個細胞膜。因此，它可以用于固定和活細胞之中。

第二種被廣泛使用的DNA 染色劑就是 Hoechst 染料系列，這些染料原先都是由 Hoechst AG 這家化學公司生產的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均為雙苯酰亞胺，可嵌入 A-T 富集區域，因此，該系列染料很少用到。與 DAPI 相似，這三種染色劑都可受大發射波長為455 nm的紫外光激發，而未被結合的染色劑，其大發射波長在 510–540 nm 之間。Hoechst 染色劑還具有細胞滲透性，因此可用于活細胞或已固定的細胞中。該染色劑與DAPI 的不同之處在于，它們的毒性較低。

碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一種不能透過細胞膜的 DNA 染色劑。由于具備上述特性，該染色劑無法進入完整的細胞中，因此，該染色劑常用于區分細胞群中的活細胞和死細胞。此外，碘化丙啶還是一種嵌入劑，但對于不同的堿基并不存在結合的差異性。該染色劑與核酸結合后，大激發波長為538 nm，大發射波長為 617 nm。未結合 PI 的大激發和發射波長和光強會更低一些。PI 還可結合 RNA，同時無需改變自身的熒光特性。有時候為了區分DNA 和 RNA，有必要使用適當的核酸酶。

不需要前期處理，吖啶橙就可以鑒別DNA 與 RNA 。吖啶橙與 DNA 結合后，大激發/發射波長為 502 nm/525 nm，而與 RNA 結合后，大激發/發射波長為460 nm/650 nm。此外，它還能夠進入溶酶體等酸性區室。在這里，陽離子染料被質子化。在這種酸性環境下，吖啶橙由藍色光譜中的光激發，但發射波長在橙色區域達到大。由于凋亡細胞具有大量被吞噬的酸性區室，因此，吖啶橙常用作此類細胞的標記物。

 

 

區室和細胞器特異性染料

在熒光顯微鏡技術中，往往要對溶酶體、核內體等細胞區室以及線粒體等細胞器進行染色。為此，該部分介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。

觀察線粒體常用的方法就是利用 MitoTracker®，它是一種可透過細胞的染料，包含輕度巰基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應，從而與基質蛋白實現共價結合。MitoTracker® 有不同的顏色和修飾類型（參見表 1），此外，它還是 Molecular Probes 的商標。與羅丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常規線粒體特異性染色劑不同，在用固定劑破壞膜電位后，MitoTracker®不會被洗掉。

依據線粒體染色劑，還有些染料可以標記溶酶體等酸性區室，這類染料被稱為LysoTracker。它們由連接一個熒光基團的弱堿基團組成，具有膜穿透性。有可能的情況是，這些堿基因質子化作用的影響而對酸性區室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇（參見表 1）。

與溶酶體相似的區室是釀酒酵母等真菌中的液泡，這種膜密閉空間也是一種酸性環境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區室，則要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。

對于蛋白質分泌實驗，內質網 (ER) 具有重要的研究意義。對上述區室進行染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好 ER，但仍會結合線粒體等其他細胞器膜。對ER 進行特異性染色的另一種方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的兩種染料，其與格列本脲（一種磺酰基脲酶）連接，并可與僅存于內質網膜上的ATP敏感性鉀通道結合。BODIPY（硼-二吡咯亞甲基，boron-dipyrromethene）是一種幾乎不溶于水的、對pH 相對不敏感的染料基團，該染料對蛋白質標記沒太大用處，但卻是脂質和膜標記的良好工具。

對于與ER相鄰的高爾基體，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等熒光神經酰胺類似物對其進行標記。 上述神經酰胺為鞘脂類，其在高爾基體中高度富集。

借助基于脂質的染料，可以對脂筏等特異膜區域進行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以觀察膽固醇富集區域（Avanti Polar Lipids）。

除了使用特異性非蛋白熒光染料對細胞區室進行標記之外，還可以借助對細胞中不同位置有偏好的蛋白質對目標區域進行染色。這些蛋白質可以和熒光染料相連，并可通過熒光顯微鏡進行觀察。運用這種方法的一個實例是：麥胚凝集素(WGA) 可以與細胞質膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結合，將WGA 與熒光染料偶聯，這樣我們就可以觀察到細胞質膜了。

圖 4：Pukinje細胞，小鼠小腦皮質三重標記的縱側截面圖。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3；綠色：anti-GFAP/Cy5；藍色：Hoechst 33258

 

圖 5：牛肺部內皮細胞。紅色：用 MitoTracker®Red CMXRos 標記的線粒體；綠色：用綠色熒光 BODIPY®FLphallacidin 標記的纖維狀肌動蛋白；藍色：用 DAPI 標記的細胞核。使用三維盲反褶積可以改善該圖像的質量。