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熒光顯微鏡技術的基本原理是借助熒光劑讓細胞成分呈現高度具體的可視化效果，比如在目的蛋白后面連一個通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中，目的基因無法進行克隆，則需要用免疫熒光染色等其他技術手段來觀察目的蛋白。為此，就需要利用抗體，這些抗體連接各種不同的熒光染料，直接或間接地與相應的靶結構相結合。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡技術不只局限于蛋白質，它還可以對核酸、聚糖等其他結構進行染色，即便鈣離子等非生物物質也可以檢測出來。本文就對幾種常用的熒光劑進行了具體的介紹。

 

 

免疫熒光 (IF)

在熒光顯微鏡技術中，可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：利用內源熒光信號，即通過克隆手段，用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連；或利用熒光標記的抗體特異性結合目的蛋白。有些生物學問題采用第二種方法會更有用或更有必要。比如，組織學樣品無法使用熒光蛋白，因為通常來說，標本都是從無法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外，當有一個有功能的抗體可用時，免疫熒光法會比熒光蛋白技術快很多，因為后者必須先克隆目的基因再將DNA轉染到適當的細胞中。熒光蛋白的另一項劣勢在于其本身屬于蛋白質。因此，細胞內的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質特性，其會導致附著的目的蛋白質發生功能紊亂或出現誤釋的情況。然而，熒光蛋白技術仍然是觀察活細胞的首選方法。

免疫熒光法利用了抗體可以和相應抗原特異性結合的這個特性，對此它還有兩種不同的表現形式。簡單的方式是使用可與目的蛋白相結合的熒光標記抗體。這種方法被稱為“直接免疫熒光法”。

在很多情況下，我們可以利用兩種不同特性的抗體。第一種抗體可以結合目的蛋白，但其本身并未進行熒光標記（一抗）。第二種抗體本身就攜帶熒光染料（二抗），并且可以特異性結合一抗。這種方法被稱為“間接免疫熒光法”。這種方法存在諸多優勢。一方面，它會產生放大效應，因為不只一個二抗可以與一抗相結合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標記目的蛋白的每個抗體，但可以使用市售熒光標記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor®染料，下文均有提及。

 

 

FITC 和 TRITC

異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術中。在 495/517 nm 處，該染料會產生激發/發射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應基團與不同抗體結合，該基團可以和蛋白質上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團相結合。而它的基本成分—— 熒光素，其摩爾質量為 332 g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術的首批染料，且其被當成 Alexa Fluor®488 等后續熒光染料的發端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統，而該系統受藍色光譜中的光所激發。

經常與 FITC 同時使用的另一種染料是與其相似的TRITC [四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與 FITC 相反，TRITC 并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統，正是該系統引發了它們的熒光行為。還有一點與FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由大波長為 550nm的綠色光譜中的光所激發，它的大發射波長為 573 nm。與蛋白質（例如，抗體）結合也基于異硫氰酸鹽反應基團。

雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它們屬于發光相對較弱的熒光染料且它們的優勢僅僅是經濟實惠，因此，在新的顯微鏡技術中并不推薦。

 

 

圖 1：果蠅胚胎發育，綠色：FITC；紅色：TRITC

 

 

青色素

這類熒光染料相對較少，從青色素衍生而來，也是其名稱的由來：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反應基團與核酸或蛋白相連。例如，采用了蛋白標記的馬來酰亞胺基團。有趣的是，對于熒光，Cy5 對其周邊電子環境非常敏感，該特征可用于酶測定。附著蛋白質的構象改變會導致熒光發射產生陽性或陰性變化。此外，Cy3 和 Cy5 還可用于 FRET 試驗。青色素染料是一種相對較老的熒光染料，但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產率等方面得以改善的基礎。